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Laboratoire d'Ecogéochimie des Environnements Benthiques
UMR 8222

Techniques photométiques

Spectrophotométrie

 

La technique de spectrophotométrie ou d'absorptiométrie est basée sur la propriété de la matière, et plus particulièrement de certaines molécules, d'absorber certaines longueurs d'ondes du spectre UV-visible. Elle permet de réaliser des dosages grâce à la loi de Beer-Lambert qui montre une relation de proportionnalité entre l'absorbance et la concentration, aussi bien qu'une étude structurale des complexes par l'étude des spectres d'absorption. Cette méthode est basée sur l'utilisation d'un spectrophotomètre qui détermine l'absorption d'une solution pour une longueur d'onde donnée ou pour une plage de longueurs d'ondes judicieusement choisie.

 Dosage des glucides totaux

 Méthode de Dubois et al. (1956). Les glucides en milieu acide sulfurique et à chaud sont déshydratés en dérivés du furfural qui se combine facilement avec le phénol et donnent une coloration rose-saumon (le glucose fournit de l'hydroxyfurfural). L'absorbance est lue à la longueur d'onde de 490 nm. La coloration est permanente. Cette méthode est très sensible puisqu'elle permet de détecter des quantités de glucides pouvant atteindre 1 µg.

- M. Dubois, K. A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers, and Fred Smith (1956). Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Analytical Chemistry, volume 28 (3) 350-356.

 

Dosage des lipides totaux 

Méthode de Barnes et Blackstock (1973) qui est basée sur la réaction sulfophosphovanillique décrite par Chabrol et Charonnat (1937) et reprise par Schmitt et Drevon (1965). Cette réaction met en oeuvre des réactifs acides concentrés (H2SO4, H3PO4) et une solution de vanilline, qui fournit une coloration rose dont l'absorbance est mesurée à 520 nm.

- H. Barnes and J. Blackstock (1973). Estimation of lipids in marine animals and tissues: detailed investigation of the sulphophosphovanillin for 'total' lipids. J. exp. Mar. Biol. Ecol., 12, 103-11.

Dosage des protéines totales 

 Méthode de Lowry et al. (1951), modifiée par Hartree (1972) et modifiée par Rice (1982) pour compenser l'interférence entre les composés phénoliques et le réactif de Folin. Cette méthode est basée sur la capacité des complexes protéines-cuivre à réduire le réactif de Folin en induisant une coloration bleue. L'intensité de la coloration est mesurée à la longueur de 750 nm.

- Oliver H. Lowry, Nira J. Rosebrough, A. Lewis Farr, and Rose J. Randall (1951). Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 12, 103-118.

- E. F. Hartree (1971). Determination of protein: A modification of the Lowry method that gives a linear photometric response . Analytical Biochemistry (48), 422-427.

- Donald L. Rice (1982). The ditritus nitrogen problem: new observations and perpectives from organic geochemistry. Marine Ecology Progress Series (8) 153-162.

Dosage des protéines disponibles 

 Méthode de Mayer et al. (1986) permet de doser les polypeptides (> 10-25 acides aminés) présent dans les sédiments et qui ne sont pas fortement liées aux substances humiques.

Après une double extraction à la soude (0.1M) et à chaud (60°C), le surnageant isolé est neutralisé. Il est alors reparti entre 5 tubes qui vont recevoir respectivement un mélange de protéases (E et K) pour le premier, de l’eau ultrapure pour le deuxième et des concentrations croissantes de caséine pour les trois derniers. L’hydrolyse enzymatique dure une nuit à température ambiante et est suivie d’un passage au bain-marie (1h à 60°C et 1h à 80°C) afin d’achever l’extraction des protéines et l’hydrolyse des protéases restantes. Après réaction des protéines avec le bleu de Coomassie, l’intensité de la coloration est mesurée à 595 nm.

La différence de densité optique entre le 2ème et le 1er tube correspond à la réaction avec les protéines disponibles. Les densités optiques des 3 autres tubes constituent la série d’étalons de caséine à partir de laquelle les densités optiques sont converties en concentrations de protéines.

- Mayer, L. M., Schick, L. et Setchell, F.W. (1986). Measurement of protein in nearshore marine sediment. Mar. Ecol. Prog. Ser., 30, 159-165.

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06/03/16