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Laboratoire d'Ecogéochimie des Environnements Benthiques
UMR 8222

Techniques fluorimétriques

La Spectrofluorimétrie 

 

La technique de spectrofluorimétrie ou spectrométrie de fluorescence permet la mesure et l'étude des spectres de fluorescence.

Principe de la fluorescence : Une molécule fluorescente (naturelle ou obtenue par formation d'un dérivé) possède la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse (lumière d'excitation) et de restituer rapidement une franction de cette lumière absorbée sous forme de lumière fluorescente (lumière d'émission) à une longueur d'onde supérieure. La molécule est excitée par absorption de photons provenant de la source lumineuse. La desexcitation se traduit par un rayonnement de fluorescence envoyé dans toutes les directions. La loi fondamentale de la fluorimétrie est que l'intensité du rayonnement émis par fluorescence est proportionnelle à la concentration de la molécule interceptant le faisceau lumineux.


 

 Dosage des chlorophylles et des phéopigments

Le dosage de la chlorophylle a et de la phéophytine a se fait après extraction dans de l'acétone à un pourcentage final de 90%. Il est également possible de doser simultanément les chlorophylles b et c ainsi que les phéopigments b et c. Ce dosage peut être réalisé après filtration sur filtre ou à partir du sédiment.

 Dosage des acides aminés totaux et disponibles

Extraction des acides aminés

Les acides aminés totaux sont extraits de l'échantillon par une hydrolyse acide (HCl 6N) et totale pendant 24 heures à 100 °C dans une ampoule scellée sous vide.

Les acides aminés disponibles sont extraits selon l'approche biomimétique de Mayer et al. (1995). L'échantillon est empoisonné par une solution d'inhibiteurs composée d'arséniate de sodium et de pentachlorophénol afin d'éviter l'absorption par les bactéries des acides aminés ultérieurement hydrolysé (1 heure à température ambiante). L'hydrolyse enzymatique est ensuite assurée par une enzyme protéolytique non spécifique et non autohydrolysable (protéinase K). Une première centrifugation élimine le matériel particulaire restant. Elle est suivie d'une précipitation des macromolécules à l'acide tricloracétique puis d'une deuxième centrifugation qui permet d'éliminer l'enzyme et les polymères de plus de 15 acides aminés. La fraction finalement isolée contient des mono- et petits oligomères (7-15 acides aminés). Elle est hydrolysée à l'HCL 6N pendant 24 heures à 100 °C dans une ampoule scellée sous vide.

Quantification

La détermination de la concentration en acides aminés se fait après dérivation à l'orthophtaldialdéhyde (OPA) selon la méthode de Lindroth et Mopper (1979) (formation de dérivés fluorescents d'acides aminés par ajout d'une solution d'OPA et de B-mercaptoéthanol). La conversion en concentration après mesure de la fluorescence est effectuée par comparaison avec une solution étalon contenant 19 acides aminés.

- Mayer LM, Schick LL, Sawyer T, Plante CJ, Jumars PA, Self RL (1995) Bioavailable amino acids in sediments : a biomimetic, kinetics-based approach. Limnol Oceanogr 405 11-520

- Lindroth, P., and Mopper, K. (1979). High performance liquid chromatographic determination of subpicomole amounts of amino acids by precolumn fluorescence derivatization with o-phthaldialdehyde.Analyt. Chem.,51, 1667-74.

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06/03/16